У працэсе правядзення генетычных даследаванняў мы часта сутыкаемся з недастатковымі ўзорамі РНК, напрыклад, для вывучэння малюсенькіх анатамічных пухлін паражніны рота, нават з аднаклетачнымі ўзорамі і ўзорамі спецыфічных генных мутацый, якія транскрыбуюцца на вельмі нізкім узроўні ў клетках чалавека.Вядома, для тэсту на COVID-19, калі мазкі не ў патрэбным месцы або не дастаткова разоў падчас адбору пробаў, памер выбаркі будзе вельмі малым, таму Камісія аховы здароўя і планавання сям'і выступіла два дні таму і прайшоў тэст, і калі ўзор нуклеінавых кіслот не ўзяў шэсць узораў, вы можаце паведаміць пра гэта.
Адчувальнасць рэагента важная, таму што ў нас ёсць тая ці іншая праблема, так што мы можам зрабіць, каб палепшыць адчувальнасць RT-PCR?
Перш чым абмяркоўваць магчымыя рашэнні, згадаем дзве вялікія складанасці сітуацыі, пра якую мы толькі што згадалі.
Перш за ўсё, мы турбуемся аб страце РНК, калі ў нашай выбарцы толькі некалькі папуляцый клетак.Пры выкарыстанні традыцыйных метадаў падзелу і ачысткі, такіх як калонкавы метад або метад асаджэння нуклеінавых кіслот, існуе вялікая верагоднасць таго, што некалькі ўзораў будуць страчаны.Адно з рашэнняў - дадаць малекулу-носьбіт, напрыклад тРНК, але нават у гэтым выпадку няма гарантыі, што наш эксперымент па аднаўленні ў парадку.
Такім чынам, што лепш?Добрым варыянтам для культывавання клетак або мікраанатамічных узораў з'яўляецца выкарыстанне прамога лізісу.
Ідэя заключаецца ў тым, каб падзяліць клеткі на 5 хвілін, выпусціць РНК у раствор, затым спыніць рэакцыю на 2 хвіліны, затым дадаць лізат непасрэдна ў рэакцыю зваротнай транскрыпцыі, каб РНК не страцілася, і, нарэшце, увесці атрыманую кДНК непасрэдна у рэакцыю ў рэжыме рэальнага часу.
Але што, калі з-за абмежаванай адпраўной кропкі або невялікай колькасці экспрэсіі мэтавага гена мы можам перапрацаваць усю РНК і пры гэтым не даць дастаткова шаблонаў для атрымання добрага сігналу ў рэальным часе?
У гэтым выпадку этап папярэдняга ўзмацнення можа быць вельмі карысным.
Ніжэй прыведзена схема павышэння адчувальнасці пасля зваротнай транскрыпцыі.Перш чым пачаць, нам трэба спытаць, якія мішэні нас цікавяць, каб распрацаваць канкрэтныя праймеры для гэтых мішэняў для папярэдняй ампліфікацыі.
Гэта можа быць дасягнута шляхам стварэння змешанага праймера з да 100 пар праймераў і цыклам рэакцыі ад 10 да 14 разоў.Такім чынам, Master Mix, спецыяльна распрацаваны для гэтага патрабавання, неабходны для папярэдняй ампліфікацыі атрыманай кДНК.
Прычына ўстанаўлення колькасці цыклаў паміж 10 і 14 заключаецца ў тым, што гэтая абмежаваная колькасць цыклаў забяспечвае выпадковасць паміж рознымі мэтамі, што вельмі важна для даследчыкаў, якім патрэбна колькасная малекулярная інфармацыя.
Пасля папярэдняй ампліфікацыі мы можам атрымаць вялікую колькасць кДНК, так што адчувальнасць выяўлення на бэк-энд значна паляпшаецца, і мы можам нават разбавіць узор і правесці некалькі рэакцый ПЦР у рэальным часе, каб ліквідаваць магчымыя выпадковыя памылкі.
Час публікацыі: 11 красавіка 2023 г